Аффинная Хроматография

(от лат. Affinis - родственный) (биоспецифич. Хроматография, хроматография по сродству), метод очистки и разделения белков, основанный на их избират. Взаимод. С лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем. В кач-ве лигандов используют соед., взаимод. К-рых с разделяемыми в-вами основано на биол. Ф-ции последних. Так, при разделении ферментов (для чего преим. И применяется А. Х.) лигандами служат их субстраты, ингибиторы или коферменты. Главная особенность, к-рая обусловливает высокую эффективность А. Х., состоит в том, что разделение основано на различии не физ.-хим. Признаков молекулы (заряда, формы и размера), а специфич. Функциональных св-в, отличающих данный фермент от множества др. Биополимеров. Неподвижная фаза в А.

Х. Представляет собой специально получаемый сорбент, построенный обычно по схеме. Носитель - соединяющее звено ("ножка") - специфич. Лиганд. Носителем служит чаще всего сефарозапроизводное агарозы, имеющее поперечные сшивки. Присоединение к ней лиганда или "ножки", содержащих, как правило, аминогруппу, осуществляется после активации сефарозы бромцианом. Содержание лиганда колеблется от 0,1 до 10 мкмоль на 1 г влажного сорбента. Сефароза, однако, малоустойчива к действию ряда хим. В-в и микроорганизмов. Более стабильны макропористые неорг. Носители (кремнезем, стекло) и орг. Полимеры. Если лиганд присоединяется непосредственно к носителю, эффективность специфич. Взаимод. С ферментом заметно снижается вследствие пространств.

Затруднений. "Ножка", как правило, устраняет стерич. Препятствия, отдаляя лиганд от носителя. Как и носитель, она должна быть инертной и не влиять на процессы в ходе А. Х., чего, однако, не всегда удается достигнуть. Напр., присоединение "ножки" по приведенной выше р-ции приводит к образованию катионной группировки изомочевины, и сорбент приобретает св-ва анионита. В кач-ве "ножки" используют обычно ди- и полиамины,аминокислоты, пептиды, олигосахариды. Лигандами могут служить субстраты (напр., крахмал или гликоген при разделении амилаз), однако их превращ. В ходе А. Х., катализируемое разделяемым ферментом, постоянно изменяет св-ва сорбента. Поэтому, как правило, применяют аналоги субстратов, устойчивые к дальнейшему превращ., т.

Е. Ингибиторы ферментов. Так, для выделения протеиназ используют не расщепляемые ими пептиды D-аминокислот. Эффективны прир. Ингибиторы ферментов, напр. Пепстатин - ингибитор аспартильных протеиназ. Иногда применяют лиганды, связывающие большие группы родственных ферментов (в частности, киназы и дегидрогеназы). Примеры таких "группоспецифич." лигандов-антрахиноновые красители, аналоги никотинамидадениндину-клеотида. Известны лиганды (напр., производные фенилборной к-ты), имитирующие при взаимод. С ферментом структуру переходного комплекса с субстратом. Такие лиганды эффективны при выделении сериновых гидролаз. Разделение в А. Х. Обычно проводят на хроматографич. Колонках. Иногда разделяемую смесь помещают в сосуд с сорбентом и выдерживают до полного связывания исследуемого компонента.

Затем сорбент (в колонке или сосуде) промывают буферным р-ром для удаления несвязавшихся в-в, после чего десорбируют исследуемый компонент. Десорбция (элюция) последнего обычно достигается повышением ионной силы, изменением рН буферного р-ра или добавлением в него орг. Р-рителя, что ослабляет взаимод. Лиганд - фермент. Более избирательна десорбция р-ром лиганда. Помимо ферментов, методом А. Х. Можно выделять также токсины, рецепторы, ингибиторы, транспортные белки и др. Биологически активные в-ва. Высокой избирательностью отличается т. Наз. Иммуносорбция, при к-рой в кач-ве лиганда используют антитела, обладающие специфичностью к выделяемым белкам. Особенно эффективны моноклональные антитела. Для разделения белков применяется также ряд др.

Аналогичных методов. Т. Наз. Ковалентная хроматография основана на избират. Образовании и последующем расщеплении ковалентных связей между выделяемым в-вом и носителем, напр. Между белком с SH-группами и ртуть-орг. Производными агарозы. Применяется также лигандообменная хроматография, при к-рой ферменты связываются через функциональный ион металла с комплексоном, иммобилизованным на носителе. Получила распространение гидрофобная хроматография, при к-рой сорбент (напр., фенилсефароза), содержащий гидрофобные группировки, вкрапленные в гидрофильную матрицу, взаимодействует с гидрофобными участками, содержащимися на пов-сти белков. Нередко при этом наблюдаются также ионообменные взаимод., как, напр., при использовании в качестве сорбента алкиламиносефароз.

Избират. Выделение гликопротеинов обеспечивают иммобилизованные на носителях лектины - белки, специфически взаимодействующие с концевыми моносахаридными звеньями углеводных цепей. Иммобилизованные субъединицы ряда белков с четвертичной структурой м. Б. Использованы для извлечения этих белков из сложных смесей вследствие специфич. Межсубъединичных контактов. А. Х. Сформировалась как метод в кон. 60-х гг. 20 в. Лит. Туркова Я. Аффинная хроматография, пер. С англ. М., 1980. В. М. Степанов. .