Ферментативные методы анализа

методы количественного определения химических веществ в растворе, основанные на использовании ферментов (См. Ферменты). С помощью Ф. М. А. Определяют вещества, способные участвовать в химических реакциях, катализируемых ферментами, а также являющиеся активаторами либо ингибиторами ферментов. Ф. М. А. Характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью, поскольку ферменты катализируют превращения веществ с большой скоростью и высоко избирательно, даже если анализируемое соединение находится в смеси с др. Близкими по химическому строению веществами. При определении субстрата ферментативной реакции к анализируемой пробе прибавляют фермент и др. Необходимые для реакции компоненты. По окончании реакции тем или иным удобным методом устанавливают в растворе содержание продукта реакции.

Например, определение этилового спирта в растворе с помощью фермента алкогольдегидрогеназы (АДГ) производится при участии кофермента АДГ – Никотинамидадениндинуклеотида (НАД). Последний в ходе ферментативной реакции количественно превращается в восстановленный НАД, обладающий, в отличие от окисленной формы, способностью к поглощению ультрафиолетового света при длине волны 340 нм. Измеряя это поглощение, можно установить концентрацию восстановленного НАД и рассчитать концентрацию этилового спирта. Метод позволяет определить 1 мкг спирта в 1 мл раствора. Многие Ф. М. А. Основаны на определении изменения кислотности раствора в ходе ферментативной реакции. Например, эфиры карбоновых, фосфорной и др. Кислот можно определять с помощью специфических ферментов, катализирующих их гидролиз.

Поскольку при гидролизе образуются соответствующие кислоты, результат их титрования по окончании реакции позволяет рассчитать концентрацию определяемого эфира. При Ф. М. А. Часто используют комбинацию (сопряжение) нескольких ферментативных реакций. Например, концентрация глюкозы может быть определена с помощью ферментов глюкозооксидазы (ГО) и пероксидазы (ПО). Под действием ГО глюкоза превращается в глюконовую кислоту, при этом образуется перекись водорода, которая, в свою очередь, под влиянием ПО может окислить введённый в раствор ортодианизидин (или толидин) и давать окраску. Измеряя интенсивность окраски раствора, можно рассчитать исходную концентрацию глюкозы (чувствительность метода 5 мкг в пробе). Этот способ применяется для быстрого определения глюкозы в моче у больных диабетом с помощью индикаторной бумажки, пропитанной указанными реактивами.

Разновидностью Ф. М. А. Являются кинетические методы анализа, основанные на зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации анализируемых веществ (см. Ферментативный катализ), которыми могут быть субстраты, активаторы или ингибиторы ферментов. Зная характер этой зависимости, можно, измеряя скорость ферментативной реакции, рассчитать концентрацию анализируемого вещества. Например, количественное определение фосфорорганических инсектицидов, являющихся сильными ингибиторами, фермента Холинэстеразы производится путём измерения активности этого фермента в отсутствии и в присутствии ингибитора. Чувствительность метода определения, например диэтил-пара (См. Мета-, орто-, пара-)-нитрофенилфосфата, составляет 0,015 мкг в пробе, ионов магния (по активирующему их влиянию на фермент, окисляющий изолимонную кислоту) – 0,1 мкг.

Широкое распространение получили Ф. М. А., основанные на использовании ферментов, прочно связанных с твёрдыми носителями, которыми могут быть полимеры, неорганические сорбенты, гели. Такие «твёрдые ферменты», помещенные на электрохимические датчики (стеклянные, платиновые и др. Электроды), представляют собой ферментные электроды, служащие инструментами для измерения скорости ферментной реакции в растворе анализируемого вещества. С помощью ферментных электродов определяют мочевину, аминокислоты, пенициллин, глюкозу и т.д. С чувствительностью 0,1–0,01 мкг в пробе. Лит. Березин И. В., Клесов А. А., Ферментные электроды, «Успехи химии», 1976, т. 45, в. 2. Methoden der enzymatische Analyse, Hrsg. Н. U. Bergmeyer, 3 Aufl., Bd 1–2, Weinheim, 1974.

В. А. Яковлев.