Чувствительность микроорганизмов к химиопрепаратам

Св-во микроорганизмов реагировать на действие химиопрепаратов приостановкой размножения или гибелью. Каждый вид или близкая группа видов имеют характерный спектр и уровень естественной (природной) Ч. По отношению к определенному препарату или группе препаратов. В чувствительных популяциях в результате мутации, рекомбинации или иммиграции закономерно появляются особи с более узким спектром и более низким уровнем Ч., к-рые в селективных условиях среды могут стать доминирующими в популяции. Такие особи и популяции называются устойчивыми (см. Антибиотики). С научной биол.-статистической точки зрения к чувствительным относят к-ры, растущие на средах с концентрациями, не превышающими Х±2 а, и не растущие на средах, превышающих эту концентрацию.

К-ры или популяции, рост к-рых не подавляется на средах с концентрацией препарата больше Х±2 с, относят к устойчивым. В химиотерапии подход к определению чувствительности-устойчивости микроорганизмов иной, поскольку возможность создания концентрации химиопрепарата в крови и др. Тканях животного организма лимитируется рядом факторов, и прежде всего токсическим или др. Побочным действием химиопрепарата на организм. Поэтому в качестве критерия чувствительности-устойчивости микроорганизмов к химиопрепаратам избирают их терапевтические концентрации в крови и др. Биотопах животного организма. Мерой Ч. Микробов в указанном случае является минимальная концентрация препарата (мкг/мл), к-рая подавляет рост микробов на питательных средах в стандартных условиях постановки опыта (МИК).

Исходя из отношения между МИК и концентрацией препарата в крови при введении терапевтических доз, в клин, химиотерапии выделяют 3 категории чувствительности-устойчивости микробов (см. Методические указания, 1983, 1991). К чувствительным относят штаммы, рост к-рых подавляется концентрациями препарата, создаваемыми в с-ке крови б-ного в процессе назначения обычных терапевтических доз антибиотиков. Умеренно-устойчивыми 'считаются штаммы, подавляемые концентрациями, к-рые могут быть достигнуты при введении максимальных терапевтических доз препарата. К устойчивым предложено относить штаммы, рост к-рых не подавляется концентрациями препарата, создающимися введением максимально допустимых доз. Указанные категории предложены для испытания полуколичественным методом дисков В методиках серийных разведении возможна количественная оценка чувствительности-устойчивости (МИК), к-рая сопоставляется с рекомендуемыми терапевтическими дозами.

Для получения достоверных результатов испытания на Ч.м. Необходимо соблюдение ряда условий, в частности. 1) испытывают в основном чистые к-ры выделенных микробов. Смешанные к-ры из-за неодинаковых темпов роста и межвидовой конкуренции часто дают искаженные результаты. 2) из каждого материала проверяют Ч. Нескольких к-р одного вида или их смесь. При системных моноэтиологичных заболеваниях и закрытых внебольничных процессах выборка может состоять из 2-3 к-р. Открытые процессы, особенно вызванные условно-патогенными микробами, требуют большей выборки - 5-10 к-р. 3) в связи с изменением состава популяции в процессе инфекции испытание на Ч.м необходимо повторять каждые 5 - 7 дней. 4) в случаях ассоциированной инфекции предпочтение отдают испытанию Ч.м.

У видов и вариантов, занимающих доминирующее и субдоминирующее положение в микробиоценозах. 5) испытанию на Ч. Подлежат к-ры, выделенные из первичного или вторичного микробного очага. В настоящее время для определения Ч. М. Применяют 3 метода. Диффузии препарата в агар из бумажных дисков (дискодиффузионный), серийных разведении в бульоне и в плотной питательной среде. Определение Ч.м. К химиопрепаратам регламентировано Методическими указаниями по применению унифицированных клинических лабораторных исследований, утвержденными приказом МЗ СССР № 250 от 13.03.75 г. Указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков, изданными в марте 1983 г. Методическим руководством «Эпидемиологический надзор за лекарственной устойчивостью основных возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний и тактика антибактериальной терапии» (1991).

Для определения Ч.м. Необходимы стандартные заводские диски из специальной бумаги. Кустарное производство дает ненадежные результаты. Питательные среды для определения Ч.м. Должны быть стандартными. Обеспечивать оптимальные условия для роста микробов. Не содержать ингибиторов роста и избыточного количества его стимуляторов, а также веществ, подавляющих противомикробное действие антибиотиков. Иметь нейтральную или слабощелочную рН(7,0 -7,4). Для бактерий, растущих на простых питательных средах, используют бульон и 1,5 - 2% агар Хоттингера, МПБ и 1,5-2% МПА, среду АГВ. Для стрептококков и гемофильных бактерий применяют те же среды с добавлением дрожжевого гидролизата. Ч. Дрожжей определяют на Сабуро средах (см.), анаэробов - в специальных средах и анаэробных условиях.

При определении Ч. Псевдомонад необходимо присутствие в питательной среде ионов кальция и магния. Эти ионы оказывают влияние на уровень Ч. Др. Микробов к ряду антибиотиков, поэтому желательно, чтобы все среды содержали ионы этих элементов. Оптимальное их содержание в средах - 50 мг/л ионов кальция и 25 мг/л ионов магния. Иссл. Чистые к-ры, взятые из 5-10 колоний, выращивают 18 - 20 ч на МПА, готовят смесь плотностью в 10 ЕД оптического стандарта на физрастворе и разводят в 10 раз. Ход исследования. На поверхность плотной среды наливают 2 мл иссл. К-ры и покачиванием чашки равномерно распределяют ее по всей поверхности среды, остаток отсасывают пипеткой. Среду подсушивают 20 - 30 мин при комнатной температуре, после чего на поверхность газона стерильным пинцетом накладывают диски (не более 6 на чашку) на расстоянии 2 см.

Друг от друга и от краев чашки. Инкубируют в термостате 24 -48 ч при 37°С (при определении метициллина и оксациллина - при 35°С). В падающем свете, на фоне темной матовой поверхности измеряют диаметр (с учетом диаметра диска) задержки роста. Оценку результатов проводят по таблице, приведенной в упомянутой инструкции 1991 г. Диаметры зон задержки роста испытанных штаммов сравнивают с пограничными значениями в таблице и относят их к одной из 3 категорий чувствительности-устойчивости. Для сокращения объема работы ВОЗ предлагает использовать класс-диски, содержащие один из антибиотиков близкой по спектру группы. Ценным в этом плане является предложенное авторами инструкции от 1983 г. Предварительное испытание Ч.

М. Путем прямого посева патологического материала. Для контроля точности и стандартности исследований ВОЗ рекомендует параллельно с иссл. К-рами включать в опыт тест-к-ры кишечной палочки АТСС 25292, золотистого стафилококка АТСС 25923, синегнойной бактерии АТСС 27853. Для получения количественных результатов о Ч.м. Используют методы серийных разведении. Метод серийного разведения препарата в бульоне основан на определении способности растворенного в питательном бульоне препарата вызывать гибель или ингибировать рост находящихся в нем микробов. Для постановки опыта необходимы основные р-ры антибиотиков в дистил. Воде, бульон Хоттингера или др. Питательный бульон и 18-часовая бульонная к-ра иссл. Штамма с примерной плотностью в 10 м.т./мл.

Ход исследования. Из основных разведении препаратов готовят ряды в объеме 1 мл серийных разведении (по числу иссл. К-р), кратные 2, захватывающие все уровни чувствительности-устойчивости, причем для каждого разведения нужна отдельная пипетка. Во все разведения 1-го ряда доливают по 1 мл первой иссл. К-ры, 2-го ряда - по 1 мл второй к-ры и т.д. Концентрация препарата в результате этого уменьшается в 2 раза. Контроль содержит 1 мл к-ры каждого иссл. Штамма и 1 мл бульона. Инкубируют при 37°С до следующего дня. Определяют МИК, к-рая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста. Если необходимо установить бактерицидное действие МБК, из нескольких пробирок с задержкой роста делают высев петлей на секторы чашки с МПА.

Инкубируют до следующего дня и учитывают рост. За МБК принимают концентрацию препарата в последней пробирке, высев из к-рой не дал роста. Метод серийных разведении в плотной питательной среде базируется на способности растворенного в плотной питательной среде препарата ингибировать рост нанесенных на него микробов. По сравнению с методом серийных разведении в жидкой среде более производителен, чувствителен и точен. Производительность, экономичность и надежность метода резко возрастают, если иссл. К-ры наносить специальным штампом-репликатором с 25 - 50 штифтами. Ход исследования. Для опыта в бутылочках заготавливают мерное количество стерильного агара Хоттингера или МПА и 3 основные концентрации антибиотиков исходя из уровней Ч.

М. В расплавленный и охлажденный до 60°С агар добавляют нужное разведение антибиотика, равное 1/10 среды (концентрация антибиотика соответственно уменьшается в 10 раз), тщательно перемешивают и разливают по чашкам, на дне к-рых заранее должны быть указаны название и концентрация антибиотика и проведена горизонтальная черта, обозначающая «верх». Посев лучше проводить штампом-репликатором. Для этого в лунки штампа пастеровской пипеткой вносят по 5 капель 3 -4-часовой бульонной к-ры, стандартизированной по стандарту мутности в 5 ЕД. Штифты штампа опускают в лунки, смачивают к-рой и легким прикосновением переносят на поверхность агара с антибиотиками (метод реплик). Для посева на каждую новую чашку штифты вновь смачивают в лунках с к-рой.

Перед посевом на агар антибиотиками делают отпечаток к-р на среду без препарата (контроль). Посевы инкубируют в термостате при 37°С до следующего дня (до появления роста на контроле). Учет производят с помощью бумажных матриц. На них тушью нанесены цифры от 1 до 25 или 50 (в зависимости от штампа). При учете результатов посева дно чашки накладывают на матрицу так, чтобы линия «верх» совпадала с верхним рядом отпечатков, а зоны отпечатков - с цифрами. Удобно работать с 3 матрицами, чтобы последовательно учитывать Ч. К-ры на всех 3 концентрациях препарата. К-ра считается чувствительной, если в зоне отпечатков нет ни одной колонии. Микроорганизмы, рост к-рых подавлен всеми 3 концентрациями, рассматривают как чувствительные, 2-й и 3-й концентрациями - как среднечувствительные, 3-й - как умеренно устойчивые.

Микроорганизмы, растущие на всех 3 концентрациях, относят к устойчивым. При различии в уровнях устойчивости у к-р, выделенных из одного патологического материала, общую оценку устойчивости популяции делают по наиболее устойчивой к-ре. Кроме классических методов, дающих ответ относительно поздно, предложены ускоренные методы определения Ч.м., в т.ч. Автоматизированные, позволяющие получить ответ через 3-10 ч от начала исследования. Достоверность их в силу ряда причин ниже классических методов, что, однако, компенсируется быстрым получением ответа. Пограничные данные диаметра зон задержки роста и значений для интерпретации результатов испытания на Ч. М. ____________________________________________________________________________________ Антибиотики (цвет диска) Диаметры зон (мм) Диаметры зон (мм) для среды АГВ для среды АГВ ___________________________________________________________________ устойчивые умеренно чувствительные устойчивые чувствительные устойчивые __________________________________________________________________________________________ Бензилпенициллин (белый) <20 21-28 >29 >25 <12 при испытании стафилококков Бензилпенициллин (белый) при испытании стафилококков <10 11-16 >17 - - Ампициллин (белый) при испытании стафилококков <20 21-28 >29 >0,5 <25 при испытании грам- бактерий и энтерококков <9 10-13 >14 >32 <8 Карбенициллин при испытании кишечной палочки и протея (белый) <14 15-18 >19 >64 <16.